VHH抗体開発 VHH抗体開発

VHH抗体開発

VHH Antibody Discovery
  • 自営のアルパカ飼育農場
  • 年間100以上のプロジェクトを提供
  • 高い多様性とラージカパスィティ

サービス概要

VHH抗体(VHH antibody)、または単一ドメイン抗体(Single domain antibody)としても知られ、そのサイズ、溶解性、固有の安定性、および多能構築体に容易に適合させる能力など、従来の抗体フォーマットとは異なる独自の特性を持っています。これらは、一般的でないまたは隠れたエピトープを認識し、酵素ターゲットの空洞や活性部位に効果的に結合する能力を持っています。


VHHは、アルパカ、ラマ、ラクダなどのラクダ科動物から発見された重鎖のみからなる抗体から派生した最小の抗原結合断片です。これは、彼らの小さなサイズと構造によるもので、これにより従来の抗体では難しいかもしれない組織に浸透し、特定のターゲットに高い親和性で結合する能力があります。1

VHH抗体開発サービス概要

Biointronは、単一ドメイン抗体の発見分野でトップクラスの存在として確立されています。ファージディスプレイ技術を活用し、私たちの科学者チームはユーニックな単一ドメイン抗体の製造と開発に専念します。

overview

ハイライト

自営のアルパカ飼育農場

  • 300+のアルパカが利用可能
  • 1つのプロジェクトに1匹のアルパカを専用

1年間に100以上のプロジェクトを納品する実績がある

  • 様々な免疫化学、パニング、スクリーニング手法
  • 複数のアッセイ(ELISA、SPR、FACS、内在化、ADCCなど)が可能

高い多様性とラージカパスィティ

  • 高い多様性とラージカパスィティを活かし、成功を最大化
  • ライブラリのサイズは少なくとも109

アルパカVHH抗体のアフィニティ統計

  • 0%AF-5
  • 4%AF-6
  • 16%AF-7
  • 33%AF-8
  • 32%AF-9
  • 13%AF-10
  • 2%AF-11
  • 0%AF-12
  • 0%AF-13

Data source: 615 VHH antibodies (as part of our developed VHHs)

計算式

Total number of VHH of affnity 10-9 M from different target
/
Total number of VHH of from different target (615 unique sequence)
=
33%

VHH抗体の親和性が10-8から10-11Mの範囲で生成されていますが、ほとんどは10-8および10-9 Mの範囲にあります。提示されたデータは、1つのクライアントからのプロジェクトの一部を表しており、サンプリングバイアスがある可能性があります。異なるターゲット間の分散を反映していないかもしれない親和性の異なるヒットの分布です。データはSPR親和性測定から得られています。

作業フローチャート

抗原の準備
動物免疫
PBMC単離
mRNA抽出及び逆転写
ライブラリ構築
ライブラリーのスクリーニングおよびカスタマイズされたバイオパニング(固相/液相パニング)
ポジティブクローンのシーケンシングとシーケンス解析
VHH抗体発現
VHHの検証

VHH抗体の応用

VHH抗体は、その小さなサイズや遺伝子工学的な操作が可能な特性などの特徴から、臨床治療や免疫診断、環境モニタリングなど、さまざまな分野で幅広く活用されています。 2


リコンビナント抗体医薬品: 抗腫瘍治療の中で、VHH抗体の1つであり、血栓性血小板減少性紫斑病や血栓症の治療に使用されています。 3


キメラ抗原受容体(CAR-T)療法: CAR構造内では、VHH抗体はその独特な特性や製造の容易さから、通常CAR-Tの抗原結合ドメインとして使用されます。 4

VHH抗体開発
サービスの詳細

ステップ 詳細 作業時間 納品
① 抗原の準備/抗原の検証
  • Biointronは抗原を準備することもできるし、お客様からの提供も可能である。
抗原準備には2週間、検証には2〜3日
  • 1mg精製されたタンパク質抗原
  • 抗原がお客様から提供される場合、SDS-PAGE>95%、エンドトキシン<1EU/mg 抗原>4mg
② アルパカの免疫化とPBMCの単離/保存
  • 5mlの免疫前血清を回収します。
  • 2回目、3回目、および4回目の免疫後、血清のELISAテストを実施し、その結果を報告します。
  • 第2回、第3回、第4回の免疫後、50mlのPBMCを回収し、Trizolで保存します。
8-10週間
  • アルパカが抗原によって死亡した場合、設定料が75万円かかります。
  • 決定ゲート: 2回目、3回目、および4回目の免疫後のELISA滴定に基づいて、お客様はライブラリー生成に使用するPBMCを選択できます。
③ VHHファージライブラリの構築
  • RNA抽出とcDNA調製
  • VHH増幅
  • エレクトロポレーション用コンピテントセル
  • ライブラリーの多様性とカパスィティの測定
3-4週間
  • VHHカパスィティは108から109に達します。
④ ライブラリーバイオパニング及びスクリーニング
  • 少なくとも3回のパニング(液相または固相パニング)
  • ELISA検証、ポジティブクローンスクリーニングの同定と評価
  • ポジティブクローンのシーケンス解析とシーケンス結果の解析
3-4週間
  • 少なくとも20のユニークな配列を提供することを保証します。
VHH-Fc抗体の産生(オプション)
  • 遺伝子合成、サブクローニング、プラスミドの準備
  • 一過性発現と精製
  • QC
2週間
  • 精製された抗体 (SDS-PAGE >95%, endotoxin level <1EU/mg)
アフィニティランキング(オプション) Biacore 8Kにより、アフィニティを測定 0.5週間

事例研究

  • Case 1:Anti-X Antigen
    After panning and screening, 53 unique sequences were obtained & expressed in HTP CHO expression system.
    Validation by ELISA against Antigen X
    vhh-case1-1
    vhh-case1-2
    vhh-case1-3
    vhh-case1-4
    49 of 53 VHH Antibodies bound to X in ELISA
    Validation by SPR against Antigen X
    vhh-case1-5
    • 5Not Binding
    • 9E-7
    • 21E-8
    • 16E-9
    • 2E-10
    Affinity range 5.36x10-7 M to 7.66x10-10 M.
    48 of 53 VHH Antibodies bound to X in SPR
    Validation by flow cytometry against CHO-K1/X overexpression cell
    vhh-case1-6
    vhh-case1-7
    vhh-case1-8
    vhh-case1-9
    43 of 53 VHH Antibodies Bound against CHO-K1/X Cell
    Validation by Agonist activity assay
    31 of 53 antibodies showed significant agonist activity (above 1.5 times Isotype value).
    Validation by Blocking assay
    vhh-case1-11
    vhh-case1-12
    vhh-case1-13
    vhh-case1-14
    18 of 53 antibodies showed significant blocking activity.
  • Case 2:VHH Antibody Discovery Multi-transmembrane target A

    First, we immunized alpacas with DNA-encoding Target A, and then boosted their immune response by Target A-overexpressing cell line. Alpaca serum can specifically bind to Target A-overexpressing cells but not to blank cells.

    vhh-case2-1
    vhh-case2-2
    vhh-case2-3

    Phage Library construction from PBMC

    Library size is ~1.1x10E10

    Insert rate >95%

    Antigen Immunization
    DNA encoding Target A 1&2
    CHO-K1-Target A 3, 4, 5
    Cell panning Input (CFU/ml) Output Output/Input
    1 2.00E+12 9.00E+07 4.50E-05
    2 1.33E+12 2.10E+08 2.10E+08
    3 2.10E+08 2.10E+08 2.10E+08
    Total clone OD450
    (293T-Target A) >0.5
    OD450
    (293T-blank) >0.1
    Combined with Target A
    clone number
    Targeted
    Clone %
    Unique
    0635-Human Target A 88 2 0 2 2.27% 1
    0635-Human Target A 88 18 12 6 6.82% 2
    0635-Human Target A 88 55 41 14 15.91% 10
    vhh-case2-4
    vhh-case2-5
    vhh-case2-6
    Among the purified antibodies, 4 of them can bind specifically to target A.
“As a dedicated scientist in the forefront of VHH antibody discovery, I am proud to contribute to Biointron’s commitment to advancing healthcare through cutting-edge biotechnology. Our VHH antibodies epitomize precision, innovation, and the relentless pursuit of scientific excellence.”
Yang Xiang
Yang Xiang
Antibody Discovery Team

FAQs

  • What are VHH antibodies?

    A VHH antibody is the antigen binding fragment of heavy chain only antibodies. They are derived from the immune system of camelids such as alpacas.

  • What are recombinant antibodies?

    Recombinant antibodies are monoclonal antibodies produced in vitro through synthetic genes and antibody fragments, instead of using hybridomas. They can take several different formats, such as full-length immunoglobulins (Ig), monovalent antibody fragments such as single-chain fragment variable (scFv) and fragment antigen-binding (Fab), and multimeric diabodies (dimeric scFvs) or triabodies (trimeric scFvs).5

  • How are VHHs isolated from camelids?

    There are several ways to isolate VHHs from camelids against a target of interest and to build a library for screening, such as immunized, naïve, and synthetic/semi-synthetic libraries. The most common approach is by immunizing camelids and building a library based on the repertoire of heavy-chain immunoglobulins.6

参考文献一覧

  • Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hammers, C., Songa, E. B., Bendahman, N., & Hammers, R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature, 363(6428), 446-448. https://doi.org/10.1038/363446a0
  • Bever, C. S., Dong, X., Vasylieva, N., Barnych, B., Cui, Y., Xu, L., Hammock, B. D., & Gee, S. J. (2016). VHH antibodies: Emerging reagents for the analysis of environmental chemicals. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 408(22), 5985. https://doi.org/10.1007/s00216-016-9585-x
  • Bannas, P., & Hambach, J. (2017). Nanobodies and Nanobody-Based Human Heavy Chain Antibodies As Antitumor Therapeutics. Frontiers in Immunology, 8, 309808. https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01603
  • Bao, C., Gao, Q., Li, L., Han, L., Zhang, B., Ding, Y., Song, Z., Zhang, R., Zhang, J., & Wu, X. (2021). The Application of Nanobody in CAR-T Therapy. Biomolecules, 11(2), 238. https://doi.org/10.3390/biom11020238
  • Muyldermans, S. (2021). A guide to: Generation and design of nanobodies. The Febs Journal, 288(7), 2084-2102. https://doi.org/10.1111/febs.15515
  • Arbabi-Ghahroudi, M. (2022). Camelid Single-Domain Antibodies: Promises and Challenges as Lifesaving Treatments. International Journal of Molecular Sciences, 23(9). https://doi.org/10.3390/ijms23095009

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